Florina Raicu, cercetător genetician și asistent universitar la UMF Carol Davila, a explicat într-un interviu pentru  G4Media.ro care sunt etapele obligatorii în realizarea unui test pentru detectarea coronavirusului și de ce România depinde exclusiv de producători străini de aparate și kit-uri necesare pentru testare.

Geneticiana Florina Raicu, doctor în genetică moleculară la Universitatea G.’Annunzio Chieti – Pescara, a explicat de ce este necesar un număr cât mai mare de teste: ”este crucială pentru că astfel înțelegem cum evoluează boala și pentru a reduce rata infectării”.

O altă problemă, pe lângă lipsa materialelor necesare, este cea a specialiștilor. Instruirea rapidă a unor noi operatori prezintă riscul lucrului sub presiune, ceea ce ar putea duce la îmbolnăvire, contaminare de probe și analize false.

Carte de vizită Florina Raicu:

– UMF Carol Davila Bucuresti, Facultatea de Medicina Generala, Catedra de Genetica Medicala – asistent universitar

– Institutul de Antropologie Francisc J. Rainer al Academiei Romane Bucuresti – cercetator stiintific

– Doctor in medicina “Magna Cum Laude” Institutul de Antropologie Francisc J. Rainer al Academiei Romane, Bucuresti

– Doctor in genetica moleculara, calificativul “Eccellente”, Scoala doctorala internationala “Functional Neuroimaging: from cells to systems”, Institutul de Tehnologii Biomedicale Avansate, Departamentul de Stiinte Clinice si Bioimaging, Universitatea G.’Annunzio Chieti – Pescara ITALIA.

• Interviul integral:

Rep: Cum se face un test pentru coronavirus, care sunt etapele?

Florina Raicu: Pentru testarea prezentei SARS-CoV-2 in primul rând este nevoie întotdeauna un spațiu de lucru adecvat, fiind vorba de virusuri, pentru a se putea respecta doua cerințe obligatorii: evitarea infectării personalului si evitarea contaminării probelor intre ele in timpul lucrului si/sau intre diverse runde de testare (rezultate fals pozitive). Acest spațiu necesita cel puțin 3 camere separate: una pentru pregătirea probelor, una pentru pregătirea reactivilor si una pentru analiza propriu-zisa (cea cu aparatele faimoase ce urmează sa se achiziționeze). Citez din broșurile pentru kiturile de testare: „Use separated working areas for specimen preparation, reaction set up and amplification”.

Apoi cerințele obligatorii sunt cele conform cărora probele trebuie manipulate intr-un spațiu de tip Biosafety Level 2 conform ghidurilor World Health Organization emise la 12 Feb 2020.

„Warning and Precautions: Testing for the presence of COVID-19 should be performed in appropriately equipped laboratories by staff trained in the relevant technical and safety procedures. National guidelines on laboratory biosafety should be followed in all circumstances” (in cazul de fata trebuie respectate cerințele autorității nationale RENAR)

Etapele de lucru generale ar fi următoarele:

1. Se recoltează steril proba biologica cu ajutorul swab-ulrilor din faringe, in general, sau din saliva.
2. Proba se duce la laborator unde in prima etapa se resuspenda proba intr-un mediu si apoi se realizează inactivarea virusului cu trizol.
3. Urmează etapa de izolare a acizilor nucleici, in cazul de fata molecule ARN printre care, alături de cele umane se afla si cele de origine virala. Fiind vorba de un virus ARN ar fi nevoie de kituri de izolare a ARN. Aceasta etapa se poate face manual sau in mod automat daca exista astfel de echipamente in dotarea laboratoarelor. In general nu cred ca au astfel de echipamente prea multe laboratoare din tara pentru ca sunt echipamente costisitoare.
4. ARN-ul izolat este revers transcris in ADN complementar.
5. Urmează analiza propriu-zisa Real Time PCR pentru detecția prezentei virusului. Se face in aparatul numit Real Time PCR prin metoda de detecție cu sonde TaqMan.

Trebuie înțeles cumva de către nespecialiști următorul lucru: in cazul in care virusul este prezent in proba, prin aceasta tehnica se poate ca un fragment redus ca dimensiune din genomul viral (un fel de secvență proprie numai acestui tip de virus), in cursul procesului artificial de „înmulțire” a numărului de copii, sa poată fi detectat automat in prezenta unor molecule sintetice marcate fluorescent care se asociază cantitativ cu numărul progresiv de ampliconi generați.

Aici, daca este necesar, pot sa fac o paranteza pur tehnica pentru explicarea principiului metodei, deși nu cred ca e nevoie.

Rep: Care sunt echipamentele de care e nevoie pentru un test?

Florina Raicu: S-a vehiculat ideea achiziționării a zeci de echipamente Real Time PCR. Nu știu exact la ce tip anume instrumente se referea dl. prim-ministru.

Pentru testarea Covid-19 kiturile si aparatele trebuie sa aibă IVD pentru a putea furniza rezultate. De la declanșarea epidemiei a existat o cursa contra cronometru pentru obținerea certificărilor IVD din partea producătorilor de echipamente si kit-uri.

Pentru echipamente nu știu pentru ce varianta se optează.

Varianta 1

Există varianta echipamentului produs de francezii de la EliTech Group care este complet automatizat – Elite InGenius Platform – fiind vorba de o platforma, dar care lucrează exclusiv cu kituri de detecție produse special. Adică este un sistem închis. Abia au obținut aprobare pe 3 martie pentru IVD (in vitro diagnostic) pentru kit-ul lor GeneFinder COVID-19 Plus RealAmp Kit produs de cei de la OSANGHealtcare special pentru platforma automatizata. Acesta platformă lucrează direct cu tuburile primare! Costa aproximativ 50000 euro din cate știu. Se merge pe varianta montării in containere a întreg sistemului din cate am înțeles. Nu știu însă cu ce abateri de la norma privind spațiul de lucru.

Kitul acesta se poate utiliza si in combinație cu alte tipuri de instrumente RT-PCR din fericire!

Varianta 2

Daca se lucrează pe varianta standard e nevoie de mai multe instrumente in afara de echipamentul propriu-zis de detecție (RT-PCR). Adică, fie se izolează acizii nucleici cu un extractor automat (de dorit si cu manipulare redusa), fie se izolează manual caz in care este nevoie de centrifuga de mare viteza, vortex, micropipete, termobloc.

Repet, oricum pentru ambele variante trebuie sa existe spațiul adecvat. Si cel puțin o hota cu exhaustare.

Rep: De ce sunt doar șapte centre în care se fac aceste testări?

Florina Raicu: Pentru ca acesta a fost probabil necesarul de pana acum.

Din câte am înțeles acum exista o mare presiune pentru efectuarea acestor testări. In general exista o problema legata in special de calitatea diferita a pregătirii celor care se pot, tehnic si teoretic, ocupa de aceste testări. Din păcate sunt foarte mulți medici care au in continuare impresia ca testarea se face cam ca la biochimie: bagi proba in aparat si scoți rezultatul gata imprimat numai bun de stampilat si semnat. Au si anunțat ca o pot face punând astfel presiune pe cei in a căror sarcina ar reveni astfel de testări: în general biologi și biochimiști.

Există o mare problemă deja între aceste două bresle, pentru ca biologii și biochimiștii sunt deja încărcați cu alte feluri de analize și sunt de trei ori mai prost plătiți. Din păcate, medicii nu se vor „coborî” la munca de jos. În multe centre, din păcate aceste teste se fac chiar de către asistenți medicali sau alți tehnicieni. Chiar și lucrul cu noua platformă, complet automatizată, necesită personal calificat pentru că rezultatul dat de instrument trebuie interpretat.

Rep: Având în vedere evoluția epidemiei în Europa și numărul mare de români veniți acasă, e suficient numărul de testări realizate până în prezent?

Florina Raicu: Testarea este de o importanță deosebita. Coreea de Sud fix asta a făcut de la momentul T0 și are cea mai mică rată de îmbolnăvire pentru ca a cuplat testarea cu izolarea. Trebuie să se cunoască precis numărul de persoane infectate și de aceea este util să se facă testare pe scara larga.

Când testarea se face la un nivel redus nu se poate obține o imagine obiectivă a fenomenului aflat în desfășurare. Este crucială pentru că astfel înțelegem cum evoluează boala și pentru a reduce rata infectării.

Rep: Apar tot mai multe informații despre lipsa kit-urilor de testare. Care poate fi motivul? Costă mult, sunt greu de procurat?

Nu știu exact care este situația legată de „lipsa kit-urilor”. Există o cerere destul de mare la nivel mondial, iar producătorii cu IVD sunt putini. Compania coreeană SeeGene si-a mărit producția de kituri angajând voluntari in fabrica. Si ei nu au fost considerați ca fiind printre producătorii cei mai buni si nu stiu daca au certificările necesare. Au cereri din 30 de tari. Fac kit-uri 10.000 pe săptămâna, fiecare kit pentru 100 probe. Costa aproximativ 20 dolari testul. Din nefericire, Romania nu are o astfel de companie care sa fabrice kituri.

Pentru sistemele deschise de analiza Real-Time se pot utiliza kit-uri de la PrimerdesignTM Ltd  – Genesig Coronavirus (COVID-19) 1.0 Real-Time PCR Assay,  precum si cel produs de Qiagen QIAstat-Dx Respiratory 2019-nCoV Panel. Nu stiu exact cat costa si ce capacitați de producție au exact. Oricum, sunt mai scumpe decât cele de la SeeGene.

Rep: De ce e nevoie acum pentru a mări numărul de teste? De aparate Real Time PCR, de kituri, de specialiști? Cum se poate rezolva penuria, dacă e vorba de o penurie?

Nu știu cum ar putea fi instruit personalul nou ca să facă astfel de testări (pe care să te poți baza) într-un timp atât de scurt. Trebuie recrutați din rândul celor cu minime deprinderi de biologie moleculară. Personal am îndoieli, pentru că pregatirea deprinderilor de lucru necesită un timp minim. Nu mi se pare o variantă optimă, deoarece vor lucra sub presiune si vor gresi. Orice greseala inseamnă contaminare de personal și implicit îmbolnăvire, contaminare de probe și kit-uri și implicit analize false, și pierderi financiare prin deteriorarea kit-urilor și instrumentelor.

Nu poti lasa balta analizele de rutina ca sa faci doar Covid-19. Cei care au expertiza trebuie degrevati de la sarcinile de rutina. De catre cine?

Daca crestem numarul de aparate asta inseamna două lucruri: aparatul ajunge la cei care deja fac analizele si creste sarcina de lucru, sau se creaza spatii noi, dar care trebuie deservite de alte persoane nou instruite.

Depindem exclusiv de producatorii mondiali de kit-uri si echipamente.

Foto: Arhiva personală

Distribuie Distribuie Comentarii